Process of Recombinant DNA technology Questions in Hindi

(D) बायोरिएक्टर एक ऐसा पात्र है जिसमें कच्चे माल को सूक्ष्मजीवों,पौधों,जानवरों या मानव कोशिकाओं का उपयोग करके जैविक रूप से विशिष्ट उत्पादों,व्यक्तिगत एंजाइमों आदि में परिवर्तित किया जाता है।
बायोरिएक्टर तापमान,$pH$,सब्सट्रेट,लवण,विटामिन और ऑक्सीजन जैसी इष्टतम विकास स्थितियां प्रदान करके वांछित उत्पाद प्राप्त करने के लिए अनुकूल वातावरण प्रदान करते हैं।
ये अनिवार्य रूप से बड़े पैमाने पर किण्वन टैंक हैं जिनका उपयोग जैव-तकनीकी उत्पादों के उत्पादन के लिए किया जाता है।

(B) $PCR$ (पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन) एक शक्तिशाली आणविक निदान तकनीक है।
इसका उपयोग संदिग्ध $AIDS$ रोगियों में वायरल $DNA$ को प्रवर्धित करके $HIV$ का पता लगाने के लिए किया जाता है,भले ही वायरस की मात्रा बहुत कम हो।
इसके अतिरिक्त,$PCR$ का उपयोग संदिग्ध कैंसर रोगियों में जीन में उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए किया जाता है,जो प्रारंभिक निदान और व्यक्तिगत उपचार में मदद करता है।
$ELISA$ मुख्य रूप से एंटीजन या एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है,जबकि $Widal$ टेस्ट टाइफाइड के लिए और $CT\, SCAN$ एक इमेजिंग तकनीक है।

(D) जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस एक ऐसी तकनीक है जिसका उपयोग $DNA$,$RNA$ या प्रोटीन जैसे आवेशित अणुओं को उनके आकार और आवेश के आधार पर अलग करने के लिए किया जाता है।
$DNA$ तकनीक के संदर्भ में,इसका उपयोग विशेष रूप से $DNA$ के टुकड़ों को उनके आकार के आधार पर अलग करने के लिए किया जाता है।
विद्युत क्षेत्र के प्रभाव में,$DNA$ के टुकड़े (जो ऋणात्मक आवेशित होते हैं) एक मैट्रिक्स (आमतौर पर एगरोज़ जेल) के माध्यम से एनोड की ओर गति करते हैं।
छोटे टुकड़े बड़े टुकड़ों की तुलना में जेल के छिद्रों से अधिक तेजी से और अधिक दूरी तक गति करते हैं,जिससे उनका प्रभावी पृथक्करण संभव हो पाता है।

(D) $Polyethylene \ Glycol$ $(PEG)$ विधि जैव प्रौद्योगिकी में उपयोग की जाने वाली एक रासायनिक-मध्यस्थ रूपांतरण तकनीक है।
इसका उपयोग मुख्य रूप से $Agrobacterium$ जैसे जैविक वाहक की आवश्यकता के बिना पादप प्रोटोप्लास्ट में आनुवंशिक सामग्री $(DNA)$ के सीधे स्थानांतरण के लिए किया जाता है।
$PEG$ एक फ्यूसोजेनिक एजेंट के रूप में कार्य करता है,जो कोशिका झिल्ली की पारगम्यता को बदलकर प्रोटोप्लास्ट द्वारा $DNA$ के अवशोषण को सुगम बनाता है।
इसलिए,यह वाहक रहित जीन स्थानांतरण (vectorless gene transfer) के लिए एक प्रसिद्ध विधि है।

(D) स्टिर-टैंक बायोरिएक्टर को वांछित उत्पाद प्राप्त करने के लिए तापमान,pH,सबस्ट्रेट,लवण,विटामिन और ऑक्सीजन जैसे विकास मापदंडों को प्रदान करके इष्टतम स्थितियां सुनिश्चित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। स्टिरिंग तंत्र का मुख्य कार्य बायोरिएक्टर में बढ़ रहे सूक्ष्मजीवों के लिए उचित मिश्रण और ऑक्सीजन की उपलब्धता सुनिश्चित करना है।

(B) ब्लू-व्हाइट स्क्रीनिंग विधि $lacZ$ जीन के निवेशन अक्रियशीलता (insertional inactivation) पर आधारित है।
$1$. $lacZ$ जीन $\beta$-गैलेक्टोसिडेज एंजाइम के लिए कोड करता है।
$2$. गैर-पुनर्संयोजित जीवाणुओं में,$lacZ$ जीन बरकरार और कार्यात्मक होता है,इसलिए जीवाणु $\beta$-गैलेक्टोसिडेज का उत्पादन करते हैं। यह एंजाइम क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट $X-gal$ के साथ प्रतिक्रिया करके नीला रंग उत्पन्न करता है।
$3$. पुनर्संयोजित जीवाणुओं में,विदेशी $DNA$ को $lacZ$ जीन में डाला जाता है,जिससे निवेशन अक्रियशीलता होती है। परिणामस्वरूप,कोई कार्यात्मक $\beta$-गैलेक्टोसिडेज उत्पन्न नहीं होता है और कॉलोनियां सफेद रहती हैं।

(D) रिस्ट्रिक्शन एंडोन्यूक्लिएज $DNA$ को विशिष्ट पहचान अनुक्रमों पर काटते हैं,जिसके परिणामस्वरूप विभिन्न लंबाई के टुकड़े उत्पन्न होते हैं।
ये $DNA$ टुकड़े फॉस्फेट बैकबोन के कारण ऋणात्मक रूप से आवेशित होते हैं।
जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस वह तकनीक है जिसका उपयोग इन $DNA$ टुकड़ों को उनके आकार (आणविक भार) के आधार पर अलग करने के लिए किया जाता है।
विद्युत क्षेत्र के तहत,टुकड़े एक मैट्रिक्स (आमतौर पर एगरोज़ जेल) के माध्यम से एनोड (धनात्मक इलेक्ट्रोड) की ओर बढ़ते हैं।
छोटे टुकड़े बड़े टुकड़ों की तुलना में जेल के छिद्रों से अधिक तेज़ी से और अधिक दूरी तक गति करते हैं,जिससे उनका पृथक्करण संभव हो पाता है।

(D) साउदर्न हाइब्रिडाइजेशन $DNA$ नमूनों में विशिष्ट $DNA$ अनुक्रमों का पता लगाने के लिए उपयोग की जाने वाली एक तकनीक है।
साउदर्न हाइब्रिडाइजेशन में शामिल चरण इस प्रकार हैं:
$1$. रिस्ट्रिक्शन एंडोन्यूक्लिएज एंजाइम द्वारा $DNA$ का पाचन।
$2$. जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा $DNA$ के टुकड़ों का पृथक्करण।
$3$. पृथक किए गए $DNA$ टुकड़ों को नाइट्रोसेल्यूलोज या नायलॉन झिल्ली पर स्थानांतरित करना (ब्लॉटिंग)।
$4$. लेबल किए गए प्रोब के साथ हाइब्रिडाइजेशन।
$5$. ऑटोरैडियोग्राफी का उपयोग करके हाइब्रिडाइज्ड प्रोब का पता लगाना।
$PCR$ (पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन) विशिष्ट $DNA$ अनुक्रमों के प्रवर्धन (amplification) के लिए उपयोग की जाने वाली एक अलग तकनीक है और यह साउदर्न हाइब्रिडाइजेशन प्रक्रिया का हिस्सा नहीं है।

(A) स्टिरर्ड-टैंक बायो-रिएक्टर बेलनाकार पात्र होते हैं जिन्हें रिएक्टर की सामग्री के मिश्रण को सुविधाजनक बनाने के लिए डिज़ाइन किया गया है।
ये एक आंदोलन प्रणाली (agitator system),ऑक्सीजन वितरण प्रणाली,फोम नियंत्रण प्रणाली,तापमान नियंत्रण प्रणाली,$pH$ नियंत्रण प्रणाली और सैंपलिंग पोर्ट से सुसज्जित होते हैं।
स्टिरिंग तंत्र का मुख्य उद्देश्य समान मिश्रण सुनिश्चित करना और सबसे महत्वपूर्ण रूप से,सूक्ष्मजीवों की वायवीय वृद्धि के लिए पूरे संवर्धन माध्यम में ऑक्सीजन की इष्टतम उपलब्धता प्रदान करना है।

(B) डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग उन प्रसंस्करण चरणों को संदर्भित करती है जो बायोरिएक्टर में उत्पाद के जैव-संश्लेषण (biosynthesis) के बाद होते हैं।
इसमें निम्नलिखित चरण शामिल हैं:
$1$. कल्चर माध्यम से उत्पाद का पृथक्करण।
$2$. उत्पाद का शुद्धीकरण।
$3$. उपयुक्त परिरक्षकों के साथ फॉर्मूलेशन।
$4$. गुणवत्ता नियंत्रण और नैदानिक परीक्षण।
'अभिव्यक्ति' (Expression) अपस्ट्रीम प्रोसेसिंग का एक हिस्सा है,जहाँ वांछित उत्पाद प्राप्त करने के लिए मेजबान जीव में जीन को अभिव्यक्त किया जाता है। इसलिए,यह डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग का हिस्सा नहीं है।

(D) $DNA$ के टुकड़ों को उनके आकार के आधार पर अलग करने की प्रक्रिया को जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस कहा जाता है।
एगारोज़ जेल पर $DNA$ के टुकड़े अलग होने के बाद,उन्हें सामान्य प्रकाश में सीधे नहीं देखा जा सकता है।
$DNA$ के टुकड़ों को देखने के लिए,जेल को इथिडियम ब्रोमाइड $(EtBr)$ नामक एक फ्लोरोसेंट डाई से अभिरंजित किया जाता है।
जब अभिरंजित जेल को $UV$ विकिरण के संपर्क में लाया जाता है,तो $DNA$ के टुकड़े चमकीले नारंगी रंग के बैंड के रूप में दिखाई देते हैं।

(B) जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस एक तकनीक है जिसका उपयोग $DNA$ खंडों को उनके आकार के आधार पर अलग करने के लिए किया जाता है।
$DNA$ अणु अपने बैकबोन में मौजूद फॉस्फेट समूहों के कारण ऋणात्मक रूप से आवेशित होते हैं।
जब विद्युत क्षेत्र लागू किया जाता है,तो $DNA$ खंड एनोड (धनात्मक इलेक्ट्रोड) की ओर बढ़ते हैं।
एगारोज़ जेल एक आणविक छलनी के रूप में कार्य करता है।
छोटे $DNA$ खंड जेल मैट्रिक्स के छिद्रों से बड़े खंडों की तुलना में अधिक आसानी से और तेजी से गुजर सकते हैं।
इसलिए,छोटे खंड बड़े खंडों की तुलना में वेल (कूप) से अधिक दूरी तय करते हैं।

(B) रिकॉम्बिनेंट $DNA$ तकनीक में,वांछित प्रोटीन के उत्पादन में दो मुख्य चरण शामिल होते हैं:
$1$. अपस्ट्रीम प्रोसेसिंग: इसमें वांछित जीन की तैयारी,उपयुक्त वेक्टर का चयन और प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए बायोरेक्टर में मेजबान कोशिकाओं का संवर्धन शामिल है।
$2$. डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग: इस चरण में मार्केटिंग के लिए तैयार करने से पहले संवर्धन माध्यम से अभिव्यक्त प्रोटीन को अलग करने और शुद्ध करने की प्रक्रिया शामिल है।
इसलिए,प्रोटीन को अलग करने और शुद्ध करने की प्रक्रिया को डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग कहा जाता है।

(B) $t-DNA$ (ट्रांसफर $DNA$) जीवाणु $Agrobacterium$ $tumefaciens$ के $Ti$ (ट्यूमर-प्रेरक) प्लाज्मिड में पाया जाने वाला $DNA$ का एक खंड है।
जब यह जीवाणु किसी पादप को संक्रमित करता है,तो यह प्राकृतिक रूप से इस $t-DNA$ को मेजबान पादप के जीनोम में स्थानांतरित कर देता है।
इस प्रक्रिया का उपयोग जैव प्रौद्योगिकी में आनुवंशिक संशोधन के लिए पादपों में विदेशी जीन को प्रवेश कराने के लिए व्यापक रूप से किया जाता है।

(A) पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन $(PCR)$ एक तकनीक है जिसका उपयोग $DNA$ के एक विशिष्ट खंड को प्रवर्धित (amplify) करने के लिए किया जाता है।
इसमें चक्रीय रूप से किए जाने वाले तीन मुख्य चरण होते हैं:
$1$. डिनेचुरेशन: दोहरी रज्जुक (double-stranded) $DNA$ को उच्च तापमान (आमतौर पर $94-98^{\circ}C$) पर गर्म किया जाता है ताकि दोनों रज्जुक अलग हो सकें।
$2$. एनीलिंग: तापमान को कम किया जाता है (आमतौर पर $50-65^{\circ}C$) ताकि प्राइमर्स एकल-रज्जुक $DNA$ टेम्पलेट पर पूरक अनुक्रमों से जुड़ सकें।
$3$. एक्सटेंशन: $DNA$ पॉलीमरेज़ एंजाइम के लिए तापमान को समायोजित (आमतौर पर $72^{\circ}C$) किया जाता है,ताकि वह प्राइमर्स में न्यूक्लियोटाइड्स जोड़कर नई $DNA$ रज्जुक का संश्लेषण कर सके।
अतः,सही क्रम डिनेचुरेशन,एनीलिंग और एक्सटेंशन है।

(D) एंजाइमों या अन्य उत्पादों के बड़े पैमाने पर औद्योगिक उत्पादन के लिए,सूक्ष्मजीवों को बड़े पात्रों में उगाया जाता है जिन्हें बायोरिएक्टर कहा जाता है।
बायोरिएक्टर वांछित उत्पाद प्राप्त करने के लिए तापमान,$pH$,सबस्ट्रेट,लवण,विटामिन और ऑक्सीजन जैसी इष्टतम विकास स्थितियां प्रदान करते हैं।
$BOD$ इनक्यूबेटर का उपयोग प्रयोगशाला स्तर पर इनक्यूबेशन के लिए किया जाता है,जबकि स्लज डाइजेस्टर का उपयोग सीवेज उपचार संयंत्रों में किया जाता है।
इसलिए,बड़े पैमाने पर औद्योगिक उत्पादन के लिए सही उपकरण बायोरिएक्टर है।

(B) रिकॉम्बिनेंट $DNA$ तकनीक की प्रक्रिया में,आनुवंशिक सामग्री $(DNA)$ के अलगाव में कई चरण शामिल होते हैं।
विशिष्ट एंजाइमों का उपयोग करके $RNA$,प्रोटीन और लिपिड जैसे अन्य जैव अणुओं को हटाने के बाद,शुद्ध $DNA$ जलीय घोल में रह जाता है।
इस मिश्रण से $DNA$ को अवक्षेपित करने के लिए,इसमें ठंडा इथेनॉल मिलाया जाता है।
यह $DNA$ को महीन धागे जैसी संरचना के रूप में अवक्षेपित करता है,जिसे स्पूलिंग (spooling) द्वारा एकत्र किया जा सकता है।

(A) रूपांतरण एक ऐसी प्रक्रिया है जिसमें एक बैक्टीरिया अपने पर्यावरण से नग्न $DNA$ को ग्रहण करता है। यह प्रक्रिया कोशिका भित्ति और झिल्ली के माध्यम से $DNA$ अणुओं का निष्क्रिय विसरण नहीं है।
यह एक सक्रिय,ऊर्जा की आवश्यकता वाली प्रक्रिया है जो केवल उन विशिष्ट बैक्टीरिया में होती है जिनमें सक्रिय ग्रहण और $DNA$ के मेजबान जीनोम में बाद के पुनर्संयोजन के लिए आवश्यक एंजाइमी तंत्र होता है।
ऐसे बैक्टीरिया की आबादी में भी,केवल 'सक्षम' (competent) कोशिकाएं,जो विशिष्ट सक्षमता कारकों (competence factors) को व्यक्त करती हैं,ही इस ग्रहण को करने में सक्षम होती हैं।
इसलिए,कथन और कारण दोनों सही हैं,और कारण यह सही व्याख्या प्रदान करता है कि यह प्रक्रिया सक्रिय क्यों है।

(C) सर्दर्न ब्लॉटिंग तकनीक एक ऐसी विधि है जिसका उपयोग नमूने में विशिष्ट $DNA$ अनुक्रमों का पता लगाने के लिए किया जाता है।
यह प्रक्रिया नमूने से $DNA$ को अलग करने के साथ शुरू होती है,जिसके बाद रिस्ट्रिक्शन एंजाइम का उपयोग करके $DNA$ का पाचन किया जाता है।
रिस्ट्रिक्शन एंजाइम आणविक कैंची के रूप में कार्य करते हैं जो $DNA$ को विशिष्ट पहचान स्थलों पर काटते हैं,जिसके परिणामस्वरूप विभिन्न लंबाई के $DNA$ खंड प्राप्त होते हैं।
पाचन के बाद,इन खंडों को जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करके उनके आकार के आधार पर अलग किया जाता है।

(C) पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन $(PCR)$ में,$n$ चक्रों के बाद उत्पन्न होने वाले $DNA$ अणुओं की संख्या $2^n$ सूत्र द्वारा दी जाती है,जहाँ $n$ चक्रों की संख्या है।
यहाँ दिया गया है कि चक्रों की संख्या $n = 4$ है,इसलिए बनने वाले $DNA$ अणुओं की संख्या $2^4 = 2 \times 2 \times 2 \times 2 = 16$ होगी।

(A) पुनर्संयोजी (recombinants) और गैर-पुनर्संयोजी (non-recombinants) को अलग करने के लिए वैकल्पिक चयन योग्य मार्कर (selectable markers) विकसित किए गए हैं,जो क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट की उपस्थिति में रंग उत्पन्न करने की उनकी क्षमता पर आधारित हैं।
जब एक पुनर्संयोजी $DNA$ को $\beta -$ गैलेक्टोसिडेज़ एंजाइम के कोडिंग अनुक्रम में डाला जाता है,तो जीन गैर-कार्यात्मक हो जाता है।
इस प्रक्रिया को इंसर्शनल इनएक्टिवेशन (निवेशित निष्क्रियता) कहा जाता है।
परिणामस्वरूप,पुनर्संयोजी प्लाज्मिड वाले बैक्टीरिया कार्यात्मक $\beta -$ गैलेक्टोसिडेज़ एंजाइम का उत्पादन नहीं कर पाते हैं।
इसलिए,वे क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट की उपस्थिति में रंग उत्पन्न करने में विफल रहते हैं,जिससे रंगहीन कॉलोनियां बनती हैं।
गैर-पुनर्संयोजी बैक्टीरिया,जिनमें इंसर्ट नहीं होता है,कार्यात्मक $\beta -$ गैलेक्टोसिडेज़ का उत्पादन करते हैं और नीले रंग की कॉलोनियां बनाते हैं।

(D) प्रत्येक कथन का विश्लेषण करते हैं:
$(a)$ फॉस्फेट बैकबोन के कारण $DNA$ ऋणात्मक रूप से आवेशित होता है। जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस में,यह धनात्मक इलेक्ट्रोड (एनोड) की ओर बढ़ता है। इसलिए,इसे कैथोड सिरे पर लोड किया जाता है,न कि एनोड सिरे पर। यह कथन गलत है।
$(b)$ $DNA$ खंड जेल के मैट्रिक्स के माध्यम से यात्रा करते हैं,न कि केवल सतह पर। जेल की सांद्रता (छलनी प्रभाव) $DNA$ खंडों की गति को काफी प्रभावित करती है। यह कथन गलत है।
$(c)$ छोटे $DNA$ खंड बड़े खंडों की तुलना में तेजी से चलते हैं और जेल मैट्रिक्स के माध्यम से अधिक दूरी तय करते हैं। यह कथन सही है।
$(d)$ $DNA$ रंगहीन होता है और इसे दृश्य प्रकाश में नहीं देखा जा सकता है। इसे एथिडियम ब्रोमाइड जैसे डाई से अभिरंजित करके फिर $UV$ विकिरण के संपर्क में लाकर देखा जाता है। शुद्ध $DNA$ को सीधे नहीं देखा जा सकता है। यह कथन गलत है।
चूंकि कथन $(a), (b)$ और $(d)$ गलत हैं,इसलिए सही विकल्प $(d)$ है।

(N/A) बायोरिएक्टर बड़े बर्तन होते हैं जिनमें कच्चे माल को सूक्ष्मजीवों,पौधों,जानवरों या मानव कोशिकाओं का उपयोग करके जैविक रूप से विशिष्ट उत्पादों,व्यक्तिगत एंजाइमों आदि में परिवर्तित किया जाता है।
ये वांछित उत्पाद प्राप्त करने के लिए इष्टतम तापमान,$pH$,सब्सट्रेट,लवण,विटामिन और ऑक्सीजन प्रदान करके विकास के लिए अनुकूल परिस्थितियाँ प्रदान करते हैं।
सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले बायोरिएक्टर स्टिरिंग प्रकार के होते हैं,जिन्हें स्टिरड-टैंक बायोरिएक्टर (stirred-tank bioreactors) के रूप में जाना जाता है।

(N/A) शेक फ्लास्क का उपयोग प्रयोगशाला में छोटे पैमाने पर वांछित सामग्री को उगाने और मिलाने के लिए किया जाता है। वांछित जैव-तकनीकी उत्पादों का बड़े पैमाने पर उत्पादन 'बायोरिएक्टर' का उपयोग करके किया जाता है। बेहतर वातन और मिश्रण गुणों के अलावा,बायोरिएक्टर के निम्नलिखित लाभ हैं:
$(i)$ नमूना लेने के लिए बायोरिएक्टर से समय-समय पर संवर्धन (cultures) की थोड़ी मात्रा निकाली जा सकती है।
$(ii)$ इसमें प्रक्रिया के दौरान बनने वाले झाग को नियंत्रित करने के लिए फोम कंट्रोल सिस्टम,pH कंट्रोल सिस्टम और तापमान नियंत्रण प्रणाली होती है।
$(iii)$ यह बैफल्स (baffles) की मदद से पूरे बायोरिएक्टर में समान मिश्रण और ऑक्सीजन की उपलब्धता को सुगम बनाता है।

(N/A) रिपोर्टर एंजाइम का उपयोग उसके संबंधित जीन की गतिविधि को ट्रैक करके मेजबान कोशिकाओं के रूपांतरण की निगरानी के लिए किया जाता है।
उदाहरण के लिए,$\beta$-गैलेक्टोसिडेज़ $(LacZ)$ एंजाइम का उपयोग ब्लू-व्हाइट स्क्रीनिंग में किया जाता है।
जब विदेशी $DNA$ का एक टुकड़ा $LacZ$ जीन में डाला जाता है,तो वह जीन निष्क्रिय हो जाता है (इंसर्शनल इनएक्टिवेशन)।
परिणामस्वरूप,रूपांतरित कोशिकाएं $\beta$-गैलेक्टोसिडेज़ का उत्पादन नहीं करती हैं और क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट की उपस्थिति में सफेद दिखाई देती हैं।
इसके विपरीत,गैर-रूपांतरित कोशिकाएं या गैर-पुनः संयोजक प्लाज्मिड वाली कोशिकाएं एंजाइम का उत्पादन करती हैं और नीले रंग की दिखाई देती हैं।

(N/A) प्रतिकृति का उद्भव: यह जीनोम में एक विशिष्ट अनुक्रम है जहाँ से प्रतिकृति शुरू होती है और जब $DNA$ का कोई टुकड़ा इस अनुक्रम से जुड़ जाता है,तो उसे मेजबान कोशिकाओं के भीतर प्रतिकृति करने के लिए बनाया जा सकता है। यह अनुक्रम जुड़े हुए $DNA$ की कॉपी संख्या को नियंत्रित करने के लिए भी जिम्मेदार है। इसलिए,यदि कोई लक्ष्य $DNA$ की कई प्रतियां प्राप्त करना चाहता है,तो इसे एक ऐसे वेक्टर में क्लोन किया जाना चाहिए जिसका उद्भव उच्च कॉपी संख्या का समर्थन करता हो।
$(b)$ बायोरिएक्टर: बायोरिएक्टर ऐसे पात्र हैं जिनमें कच्चे माल को सूक्ष्मजीवों,पादप कोशिकाओं,जंतु कोशिकाओं और/या उनके एंजाइमों द्वारा जैविक रूप से विशिष्ट उत्पादों में परिवर्तित किया जाता है। बायोरिएक्टर इष्टतम विकास स्थितियां (तापमान,$pH$,सब्सट्रेट,लवण,विटामिन,ऑक्सीजन) प्रदान करता है और वांछित उत्पादों को प्राप्त करने में मदद करता है। सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला बायोरिएक्टर 'स्टिरड-टैंक' प्रकार का है। एक स्टिरड-टैंक बायोरिएक्टर आमतौर पर एक बेलनाकार पात्र होता है या इसमें घुमावदार आधार होता है जो सामग्री के मिश्रण को सुविधाजनक बनाता है। स्पार्ज्ड स्टिरड-टैंक बायोरिएक्टर में,बाँझ हवा के बुलबुले प्रवाहित किए जाते हैं। स्टिरर पूरे बायोरिएक्टर में मिश्रण और ऑक्सीजन की उपलब्धता को सुविधाजनक बनाता है। इसमें एक एजिगेटर सिस्टम,ऑक्सीजन डिलीवरी सिस्टम,फोम कंट्रोल सिस्टम,तापमान नियंत्रण प्रणाली,$pH$ नियंत्रण प्रणाली और सैंपलिंग पोर्ट होते हैं।
$(c)$ अनुप्रवाह प्रसंस्करण: उत्पाद प्राप्त होने के बाद,इसे बाजार में तैयार उत्पाद के रूप में बेचने से पहले प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला से गुजरना पड़ता है,जिसे सामूहिक रूप से अनुप्रवाह प्रसंस्करण (डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग) कहा जाता है। दो मुख्य प्रक्रियाएं पृथक्करण और शुद्धिकरण हैं। इसके बाद उत्पाद को उपयुक्त परिरक्षकों (preservatives) के साथ तैयार किया जाता है। दवाओं के मामले में ऐसे फॉर्मूलेशन को नैदानिक परीक्षणों (clinical trials) से गुजरना पड़ता है।

(N/A) रिकॉम्बिनेंट $DNA$ तकनीक में शामिल मुख्य चरण निम्नलिखित हैं:
$(i)$ वांछित जीन वाले $DNA$ की पहचान और पृथक्करण।
$(ii)$ रिकॉम्बिनेंट $DNA$ बनाने के लिए पृथक किए गए $DNA$ को एक उपयुक्त संवाहक (vector) में डालना।
$(iii)$ रिकॉम्बिनेंट $DNA$ को परपोषी कोशिका (host cell) में प्रवेश कराना।
$(iv)$ रूपांतरित परपोषी कोशिकाओं का चयन और परपोषी में रिकॉम्बिनेंट $DNA$ का रखरखाव।
$(v)$ वांछित उत्पाद प्राप्त करने के लिए विदेशी जीन की अभिव्यक्ति।

(N/A) रिस्ट्रिक्शन एंडोन्यूक्लिएज द्वारा $DNA$ को काटने के परिणामस्वरूप $DNA$ के टुकड़े प्राप्त होते हैं। इन टुकड़ों को < strong>जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (gel electrophoresis) नामक तकनीक द्वारा अलग किया जा सकता है। चूंकि $DNA$ खंड ऋणात्मक रूप से आवेशित अणु होते हैं,इसलिए उन्हें एक माध्यम/मैट्रिक्स में विद्युत क्षेत्र की मदद से एनोड (anode) की ओर गति कराकर अलग किया जा सकता है।
आजकल सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला माध्यम एगारोज है,जो समुद्री खरपतवार (sea weeds) से निकाला गया एक प्राकृतिक बहुलक है। एगारोज जेल के छलनी प्रभाव के कारण $DNA$ खंड अपने आकार के अनुसार अलग हो जाते हैं। अतः,खंड का आकार जितना छोटा होगा,वह उतनी ही दूर तक गति करेगा। चित्र को देखें और अनुमान लगाएं कि जेल के किस सिरे पर नमूना लोड किया गया था।
पृथक किए गए $DNA$ खंडों को केवल तभी देखा जा सकता है जब $DNA$ को एथिडियम ब्रोमाइड (ethidium bromide) नामक यौगिक से अभिरंजित करके $UV$ विकिरणों के संपर्क में लाया जाए (आप शुद्ध $DNA$ खंडों को बिना अभिरंजन के दृश्य प्रकाश में नहीं देख सकते)।
एथिडियम ब्रोमाइड से अभिरंजित जेल पर $UV$ प्रकाश डालने पर $DNA$ के चमकीले नारंगी रंग के बैंड देखे जा सकते हैं (चित्र)। $DNA$ के बैंड को एगारोज जेल से काटकर बाहर निकाल लिया जाता है और जेल के टुकड़ों से अलग कर लिया जाता है। इस प्रक्रिया को क्षालन (elution) कहा जाता है। इस प्रकार शुद्ध किए गए $DNA$ खंडों का उपयोग क्लोनिंग संवाहकों के साथ जोड़कर पुनर्योजी $DNA$ (recombinant $DNA$) के निर्माण में किया जाता है।

(N/A) $DNA$ एक जलरागी (hydrophilic) अणु है,इसलिए यह कोशिका झिल्ली से होकर नहीं गुजर सकता। बैक्टीरिया को प्लाज्मिड लेने के लिए मजबूर करने हेतु,बैक्टीरियल कोशिकाओं को सक्षम बनाना आवश्यक है। यह निम्नलिखित विधियों द्वारा प्राप्त किया जाता है:
$1$. रासायनिक उपचार: बैक्टीरियल कोशिकाओं को कैल्शियम जैसे द्विसंयोजक धनायन (divalent cation) की एक विशिष्ट सांद्रता के साथ उपचारित किया जाता है। यह कोशिका भित्ति के छिद्रों के माध्यम से $DNA$ के प्रवेश की दक्षता को बढ़ाता है।
$2$. हीट शॉक विधि: $r-DNA$ को इन कोशिकाओं में प्रवेश कराने के लिए,कोशिकाओं को बर्फ पर रीकॉम्बिनेंट $DNA$ के साथ रखा जाता है,फिर $42^{\circ} C$ पर संक्षिप्त हीट शॉक दिया जाता है,और अंत में वापस बर्फ पर रखा जाता है। यह बैक्टीरिया को रीकॉम्बिनेंट $DNA$ लेने में सक्षम बनाता है।
$3$. माइक्रो-इंजेक्शन: रीकॉम्बिनेंट $DNA$ को सीधे जंतु कोशिका के केंद्रक में इंजेक्ट किया जाता है।
$4$. बायोलिस्टिक्स (जीन गन): कोशिकाओं पर $DNA$ से लेपित सोने या टंगस्टन के उच्च वेग वाले सूक्ष्म कणों की बौछार की जाती है।
$5$. निशस्त्र रोगजनक वाहक: इन वाहकों को कोशिकाओं को संक्रमित करने दिया जाता है,जिससे रीकॉम्बिनेंट $DNA$ मेजबान में स्थानांतरित हो जाता है।
$6$. इलेक्ट्रोपोरेशन: कोशिका झिल्ली को $DNA$ प्रवेश के लिए पारगम्य बनाने हेतु कोशिकाओं को उच्च वोल्टेज के विद्युत पल्स दिए जाते हैं।
$7$. लिपोफेक्शन: रीकॉम्बिनेंट $DNA$ को लिपिड की परत से ढका जाता है,जिससे यह कोशिका झिल्ली से होकर गुजर सकता है।

(N/A) रिकॉम्बिनेंट $DNA$ तकनीक में एक विशिष्ट क्रम में कई चरण शामिल होते हैं:
$1$. आनुवंशिक पदार्थ $(DNA)$ का पृथक्करण।
$2$. रिस्ट्रिक्शन एंडोन्यूक्लिएज द्वारा $DNA$ का खंडन।
$3$. वांछित $DNA$ खंड का पृथक्करण।
$4$. $DNA$ खंड का संवाहक $(vector)$ में जुड़ाव (Ligation)।
$5$. रिकॉम्बिनेंट $DNA$ का परपोषी (host) में स्थानांतरण।
$6$. परपोषी कोशिकाओं का माध्यम में बड़े पैमाने पर संवर्धन।
$7$. वांछित उत्पाद का निष्कर्षण।

(N/A) न्यूक्लिक एसिड बिना किसी अपवाद के सभी जीवों का आनुवंशिक पदार्थ है। अधिकांश जीवों में यह $DNA$ होता है।
$DNA$ को रिस्ट्रिक्शन एंजाइमों के साथ काटने के लिए,इसे अन्य मैक्रोमोलेक्यूल्स (बृहद अणुओं) से मुक्त,शुद्ध रूप में होना आवश्यक है।
चूंकि $DNA$ झिल्लियों के भीतर बंद होता है,इसलिए $DNA$ को मुक्त करने के लिए हमें कोशिका को तोड़ना पड़ता है,जिससे $RNA$,प्रोटीन,पॉलीसेकेराइड और लिपिड जैसे अन्य मैक्रोमोलेक्यूल्स भी बाहर निकल आते हैं।
यह प्रक्रिया बैक्टीरियल कोशिकाओं,पादप या जंतु ऊतकों को विशिष्ट एंजाइमों के साथ उपचारित करके प्राप्त की जाती है: बैक्टीरिया के लिए लाइसोोजाइम,पादप कोशिकाओं के लिए सेल्युलेज और कवक के लिए काइटिनेज।
$RNA$ को राइबोन्यूक्लिएज के साथ उपचारित करके हटाया जा सकता है,जबकि प्रोटीन को प्रोटीज के साथ उपचारित करके हटाया जा सकता है।
अन्य अणुओं को विभिन्न उपचारों द्वारा हटा दिया जाता है,और अंत में चिल्ड इथेनॉल मिलाने के बाद शुद्ध $DNA$ अवक्षेपित हो जाता है। इसे निलंबन में महीन धागों के संग्रह के रूप में देखा जा सकता है,जिसे स्पूलिंग द्वारा हटाया जा सकता है।

(N/A) $PCR$ का अर्थ $\text{Polymerase Chain Reaction}$ (पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन) है। इस अभिक्रिया में,दो सेट प्राइमर्स (छोटे रासायनिक रूप से संश्लेषित ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स जो $DNA$ के क्षेत्रों के पूरक होते हैं) और $DNA$ पॉलीमरेज़ एंजाइम का उपयोग करके रुचि के जीन (या $DNA$) की कई प्रतियां इन-विट्रो (पात्र में) संश्लेषित की जाती हैं।
एंजाइम अभिक्रिया में प्रदान किए गए न्यूक्लियोटाइड्स और जीनोमिक $DNA$ को टेम्पलेट के रूप में उपयोग करके प्राइमर्स का विस्तार करता है। यदि $DNA$ के प्रतिकृति की प्रक्रिया को कई बार दोहराया जाता है,तो $DNA$ के खंड को लगभग $1$ अरब गुना तक प्रवर्धित (amplify) किया जा सकता है।
इस तरह का बार-बार प्रवर्धन एक थर्मोस्टेबल $DNA$ पॉलीमरेज़ (जीवाणु $\text{Thermus aquaticus}$ से पृथक) के उपयोग से प्राप्त किया जाता है,जो दोहरे फंसे $DNA$ के उच्च तापमान-प्रेरित विकृतीकरण (denaturation) के दौरान सक्रिय रहता है। यदि वांछित हो,तो प्रवर्धित खंड का उपयोग आगे की क्लोनिंग के लिए एक वेक्टर के साथ जोड़ने के लिए किया जा सकता है।

(N/A) $PCR$ का अर्थ है पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (Polymerase Chain Reaction)। इस अभिक्रिया में,दो प्राइमरों के सेट (छोटे रासायनिक रूप से संश्लेषित ओलिगो न्यूक्लियोटाइड्स जो $DNA$ के क्षेत्रों के पूरक होते हैं) और $DNA$ पॉलीमरेज़ एंजाइम का उपयोग करके रुचि के जीन (या $DNA$) की कई प्रतियां इन-विट्रो (in vitro) संश्लेषित की जाती हैं।
एंजाइम अभिक्रिया में प्रदान किए गए न्यूक्लियोटाइड्स और टेम्पलेट के रूप में जीनोमिक $DNA$ का उपयोग करके प्राइमरों को विस्तारित करता है। यदि $DNA$ के प्रतिकृति की प्रक्रिया को कई बार दोहराया जाता है,तो $DNA$ के खंड को लगभग $1$ अरब गुना तक प्रवर्धित (amplify) किया जा सकता है। इस तरह का बार-बार प्रवर्धन एक थर्मोस्टेबल $DNA$ पॉलीमरेज़ (एक जीवाणु,Thermus aquaticus से अलग किया गया) के उपयोग से प्राप्त किया जाता है,जो डबल-स्ट्रैंडेड $DNA$ के उच्च तापमान-प्रेरित विकृतीकरण (denaturation) के दौरान सक्रिय रहता है। यदि वांछित हो,तो प्रवर्धित खंड का उपयोग अब आगे की क्लोनिंग के लिए एक वेक्टर के साथ जोड़ने के लिए किया जा सकता है।

(N/A) जुड़े हुए (ligated) $DNA$ को ग्राही कोशिकाओं में प्रवेश कराने की कई विधियाँ हैं। ग्राही कोशिकाओं को सक्षम (competent) बनाने के बाद,वे अपने आसपास मौजूद $DNA$ को ग्रहण कर सकती हैं।
यदि एंटीबायोटिक प्रतिरोध (जैसे एम्पिसिलिन प्रतिरोध) के जीन वाला एक पुनर्संयोजित $DNA$ अणु $E. coli$ कोशिकाओं में स्थानांतरित किया जाता है,तो परपोषी कोशिकाएं एम्पिसिलिन-प्रतिरोधी कोशिकाओं में रूपांतरित हो जाती हैं।
जब हम इन रूपांतरित कोशिकाओं को एम्पिसिलिन युक्त अगर प्लेटों पर फैलाते हैं,तो केवल रूपांतरित कोशिकाएं ही विकसित होंगी,जबकि अरूपांतरित ग्राही कोशिकाएं मर जाएंगी।
एम्पिसिलिन प्रतिरोध जीन के कारण,एम्पिसिलिन की उपस्थिति में रूपांतरित कोशिका का चयन करना संभव हो जाता है। इस मामले में एम्पिसिलिन प्रतिरोध जीन को वर्णयोग्य चिह्न (selectable marker) कहा जाता है।

(A) जब आप विदेशी $DNA$ के एक टुकड़े को क्लोनिंग वेक्टर में डालते हैं और इसे एक बैक्टीरियल,पादप या जंतु कोशिका में स्थानांतरित करते हैं,तो विदेशी $DNA$ का गुणन होता है।
$\Rightarrow$ लगभग सभी रिकॉम्बिनेंट तकनीकों में,अंतिम उद्देश्य एक वांछनीय प्रोटीन का उत्पादन करना होता है। इसलिए,रिकॉम्बिनेंट $DNA$ को अभिव्यक्त करने की आवश्यकता होती है।
विदेशी जीन उपयुक्त परिस्थितियों में अभिव्यक्त होता है।
यदि कोई प्रोटीन कोडिंग जीन किसी विजातीय (heterologous) मेजबान में अभिव्यक्त होता है,तो इसे रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन कहा जाता है।
$\Rightarrow$ रुचि के क्लोन किए गए जीन वाली कोशिकाओं को प्रयोगशाला में छोटे पैमाने पर उगाया जा सकता है।
$\Rightarrow$ इन संवर्धनों का उपयोग वांछित प्रोटीन निकालने और फिर विभिन्न पृथक्करण तकनीकों का उपयोग करके इसे शुद्ध करने के लिए किया जा सकता है।
कोशिकाओं को एक निरंतर संवर्धन प्रणाली में भी गुणा किया जा सकता है जिसमें उपयोग किए गए माध्यम को एक तरफ से बाहर निकाला जाता है जबकि दूसरी तरफ से ताजा माध्यम जोड़ा जाता है ताकि कोशिकाओं को उनके शारीरिक रूप से सबसे सक्रिय लॉग/एक्सपोनेंशियल चरण में बनाए रखा जा सके। इस प्रकार की संवर्धन विधि अधिक बायोमास उत्पन्न करती है,जिससे वांछित प्रोटीन की उच्च पैदावार प्राप्त होती है।

(N/A) छोटे आयतन के संवर्धन उत्पादों की पर्याप्त मात्रा प्राप्त नहीं कर सकते। बड़ी मात्रा में उत्पादन करने के लिए,बायोरिएक्टरों का विकास आवश्यक था,जहाँ संवर्धन के बड़े आयतन ($100$-$1000$ लीटर) को संसाधित किया जा सके।
बायोरिएक्टर को ऐसे पात्रों के रूप में माना जा सकता है जिनमें कच्चे माल को सूक्ष्मजीव,पादप,जंतु या मानव कोशिकाओं का उपयोग करके जैविक रूप से विशिष्ट उत्पादों,व्यक्तिगत एंजाइमों आदि में परिवर्तित किया जाता है।
एक बायोरिएक्टर इष्टतम विकास स्थितियों (तापमान,$pH$,सबस्ट्रेट,लवण,विटामिन,ऑक्सीजन) प्रदान करके वांछित उत्पाद प्राप्त करने के लिए अनुकूल परिस्थितियाँ प्रदान करता है।
सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले बायोरिएक्टर स्टिरिंग (हिलाने वाले) प्रकार के होते हैं।
एक स्टिरड-टैंक रिएक्टर आमतौर पर बेलनाकार होता है या रिएक्टर की सामग्री के मिश्रण को सुविधाजनक बनाने के लिए इसका आधार घुमावदार होता है।
स्टिरर पूरे बायोरिएक्टर में समान मिश्रण और ऑक्सीजन की उपलब्धता को सुविधाजनक बनाता है। वैकल्पिक रूप से,रिएक्टर के माध्यम से हवा के बुलबुले प्रवाहित किए जा सकते हैं।
बायोरिएक्टर में एक एजीटेटर सिस्टम,ऑक्सीजन डिलीवरी सिस्टम,फोम कंट्रोल सिस्टम,तापमान नियंत्रण प्रणाली,$pH$ नियंत्रण प्रणाली और सैंपलिंग पोर्ट होते हैं ताकि संवर्धन की थोड़ी मात्रा को समय-समय पर निकाला जा सके।

(N/A) बायोसिंथेटिक चरण पूरा होने के बाद,उत्पाद को तैयार उत्पाद के रूप में विपणन (marketing) के लिए भेजने से पहले कई प्रक्रियाओं से गुजरना पड़ता है।
इन प्रक्रियाओं में पृथक्करण (separation) और शुद्धिकरण (purification) शामिल हैं,जिन्हें सामूहिक रूप से डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग कहा जाता है।
$\rightarrow$ उत्पाद को उपयुक्त परिरक्षकों (preservatives) के साथ तैयार (formulate) किया जाना चाहिए।
$\rightarrow$ ऐसी फॉर्मूलेशन को दवाओं के मामले की तरह ही गहन नैदानिक परीक्षणों (clinical trials) से गुजरना पड़ता है।
प्रत्येक उत्पाद के लिए सख्त गुणवत्ता नियंत्रण परीक्षण (quality control testing) भी आवश्यक है।
डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग और गुणवत्ता नियंत्रण परीक्षण हर उत्पाद के लिए अलग-अलग होते हैं।

(B) डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग रिकॉम्बिनेंट $DNA$ तकनीक का एक महत्वपूर्ण चरण है जिसमें संश्लेषित उत्पाद का पृथक्करण और शुद्धिकरण शामिल है।
$1$. शुद्धिकरण: उत्पाद को बायोरिएक्टर के जटिल मिश्रण से अलग करना आवश्यक है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि यह अशुद्धियों से मुक्त है।
$2$. गुणवत्ता नियंत्रण: उत्पाद सुरक्षा और प्रभावकारिता मानकों को पूरा करता है,यह सुनिश्चित करने के लिए इसका कठोर परीक्षण किया जाता है।
$3$. फॉर्मूलेशन: उत्पाद को स्थिर बनाने और नैदानिक उपयोग के लिए तैयार करने के लिए उपयुक्त परिरक्षकों और एडिटिव्स के साथ तैयार किया जाता है।
$4$. सुरक्षा मूल्यांकन: मानव कल्याण के लिए जारी करने से पहले,उत्पाद का संभावित दुष्प्रभावों या विषाक्तता के लिए परीक्षण किया जाता है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि यह उपभोग या चिकित्सा उपयोग के लिए सुरक्षित है।

(N/A) $1$. क्लोनिंग: विदेशी $DNA$ के एक विशिष्ट खंड को उपयुक्त संवाहक (vector) में जोड़कर उसकी कई प्रतियां बनाने की प्रक्रिया को क्लोनिंग कहा जाता है।
$2$. इल्यूशन: जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के बाद एगारोज़ जेल से अलग किए गए $DNA$ खंडों को जेल के टुकड़े से काटकर बाहर निकालने और शुद्ध करने की प्रक्रिया को इल्यूशन कहा जाता है।
$3$. इंसर्शनल इनएक्टिवेशन: यह पुनर्संयोजित (recombinant) कोशिकाओं की पहचान करने की एक विधि है। जब किसी विदेशी जीन को प्लाज्मिड में मौजूद किसी चयन योग्य मार्कर (selectable marker) जीन (जैसे एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन) में डाला जाता है,तो वह मार्कर जीन निष्क्रिय हो जाता है। इस प्रक्रिया को इंसर्शनल इनएक्टिवेशन कहते हैं,जिससे पुनर्संयोजित और गैर-पुनर्संयोजित कोशिकाओं के बीच अंतर करना संभव होता है।

(B) रूपांतरण प्रयोगों में,'सक्षम' (competent) शब्द का अर्थ बैक्टीरियल कोशिकाओं की अपने परिवेश से विदेशी $DNA$ को ग्रहण करने की क्षमता से है।
सामान्यतः,$DNA$ एक हाइड्रोफिलिक अणु है और यह कोशिका झिल्ली से होकर नहीं गुजर सकता है।
इस प्रक्रिया को सुगम बनाने के लिए,बैक्टीरियल कोशिकाओं को $CaCl_2$ जैसे द्विसंयोजक धनायन की एक विशिष्ट सांद्रता के साथ उपचारित किया जाता है,जो कोशिका भित्ति के छिद्रों के माध्यम से $DNA$ के बैक्टीरिया में प्रवेश करने की दक्षता को बढ़ाता है।

(B) प्रोटीएज की भूमिका उस कोशिका के अंदर मौजूद प्रोटीन को विघटित करना है जिससे $DNA$ को अलग किया जा रहा है।
प्रोटीन अक्सर $DNA$ के साथ जुड़े होते हैं (जैसे हिस्टोन) या कोशिकीय मलबे के रूप में मौजूद होते हैं।
यदि इन प्रोटीनों को हटाया नहीं जाता है,तो वे पुनर्संयोजक $DNA$ (recombinant $DNA$) तकनीक के दौरान रिस्ट्रिक्शन एंडोन्यूक्लिएज या $DNA$ लाइगेज की क्रिया जैसी अनुवर्ती प्रक्रियाओं में बाधा डाल सकते हैं।

(B) $PCR$ प्रक्रिया में उच्च तापमान (लगभग $94-98^{\circ}C$) पर दोहरी लड़ी वाले $DNA$ को अलग करने के लिए डिनेचुरेशन चरण आवश्यक है।
यदि डिनेचुरेशन चरण छूट जाता है,तो $DNA$ दोहरी लड़ी के रूप में ही बना रहता है।
परिणामस्वरूप,प्राइमर्स टेम्पलेट $DNA$ पर मौजूद पूरक अनुक्रमों से नहीं जुड़ (anneal) पाएंगे।
अतः,$DNA$ पॉलीमरेज़ विस्तार (extension) की प्रक्रिया शुरू नहीं कर पाएगा और लक्षित $DNA$ अनुक्रम का कोई प्रवर्धन (amplification) नहीं होगा।

(A) जीन क्लोनिंग आणविक जीव विज्ञान की एक तकनीक है जिसका उपयोग किसी विशिष्ट जीन या $DNA$ खंड की कई समान प्रतियां बनाने के लिए किया जाता है।
$1$. यह प्रक्रिया वांछित जीन को अलग करने और उसे एक उपयुक्त संवाहक (जैसे प्लाज्मिड) में जोड़ने से शुरू होती है।
$2$. इससे एक पुनर्संयोजक (recombinant) $DNA$ अणु बनता है।
$3$. इसके बाद,इस पुनर्संयोजक $DNA$ को रूपांतरण (transformation) नामक प्रक्रिया के माध्यम से एक मेजबान कोशिका (आमतौर पर बैक्टीरिया) में डाला जाता है।
$4$. जैसे-जैसे मेजबान कोशिका विभाजित होती है,पुनर्संयोजक $DNA$ भी मेजबान के जीनोम के साथ प्रतिकृति (replicate) बनाता है।
$5$. अंततः,एक बैक्टीरियल कॉलोनी बनती है जहाँ प्रत्येक कोशिका में क्लोन किए गए जीन की कई प्रतियां मौजूद होती हैं।

(N/A) $E. coli$ में मानव जीन को क्लोन और अभिव्यक्त करने की प्रक्रिया में निम्नलिखित चरण शामिल हैं:
$1$. लक्षित जीन का पृथक्करण: वृद्धि हार्मोन के लिए कोड करने वाले मानव जीन को रिस्ट्रिक्शन एंजाइम का उपयोग करके अलग किया जाता है।
$2$. संवाहक (Vector) का चयन: एक उपयुक्त क्लोनिंग संवाहक,जैसे कि प्लाज्मिड,का चयन किया जाता है।
$3$. पुनर्संयोजित $DNA$ का निर्माण: $DNA$ लाइगेज का उपयोग करके मानव जीन को संवाहक में डाला जाता है ताकि पुनर्संयोजित $DNA$ बन सके।
$4$. रूपांतरण (Transformation): पुनर्संयोजित $DNA$ को मेजबान बैक्टीरिया,$E. coli$ में प्रविष्ट कराया जाता है।
$5$. चयन और स्क्रीनिंग: एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्करों का उपयोग करके रूपांतरित बैक्टीरिया का चयन किया जाता है।
$6$. अभिव्यक्ति: $E. coli$ कोशिकाओं को मानव वृद्धि हार्मोन प्रोटीन को अभिव्यक्त करने के लिए इष्टतम परिस्थितियों में संवर्धित किया जाता है।

(N/A) हाँ,किसी रोग का पता उसके लक्षण प्रकट होने से पहले लगाया जा सकता है।
सामान्यतः,किसी रोगजनक (बैक्टीरिया,वायरस,आदि) की उपस्थिति का संदेह तभी होता है जब वह रोग के लक्षण उत्पन्न कर देता है। इस समय तक शरीर में रोगजनक की सांद्रता बहुत अधिक हो चुकी होती है।
हालाँकि,बैक्टीरिया या वायरस की बहुत कम सांद्रता का पता तब भी लगाया जा सकता है जब लक्षण अभी दिखाई नहीं दे रहे हों।
इसमें निहित सिद्धांत $PCR$ (पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन) द्वारा उनके न्यूक्लिक एसिड ($DNA$ या $RNA$) का प्रवर्धन (amplification) करना है।
$PCR$ रोगजनक के विशिष्ट $DNA$ अनुक्रम की लाखों प्रतियाँ बना देता है,जिससे यदि प्रारंभिक नमूने में केवल कुछ ही प्रतियाँ मौजूद हों,तो भी उनका पता लगाना संभव हो जाता है।

(N/A) $PCR$ (पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन) एक अत्यधिक संवेदनशील तकनीक है जो बहुत कम मात्रा में उपलब्ध $DNA$ टेम्पलेट से वांछित $DNA$ अनुक्रम का विशिष्ट प्रवर्धन (amplification) करने की अनुमति देती है। इस उच्च संवेदनशीलता के कारण,यह संक्रमित रोगी में संक्रामक जीवों की उपस्थिति का पता संक्रमण के बहुत प्रारंभिक चरण में ही लगा सकता है,इससे पहले कि रोगजनक जीव मेजबान के शरीर में बड़ी संख्या में गुणा हो जाए।

(N/A) एक रेडियोधर्मी अणु (प्रोब) के साथ टैग किए गए एकल-रज्जुक $DNA$ या $RNA$ को कोशिकाओं के क्लोन में उसके पूरक $DNA$ के साथ संकरण (hybridize) करने दिया जाता है,जिसके बाद ऑटोरेडियोग्राफी का उपयोग करके इसका पता लगाया जाता है।
जिस क्लोन में उत्परिवर्तित जीन (mutated gene) होगा,वह फोटोग्राफिक फिल्म पर दिखाई नहीं देगा,क्योंकि प्रोब उत्परिवर्तित जीन के साथ पूरकता नहीं रखेगा।

(D) प्रयोग पर कोई प्रभाव नहीं पड़ेगा क्योंकि रिकॉम्बिनेंट $DNA$ अणु एक गोलाकार,बंद संरचना है जिसमें कोई मुक्त सिरे नहीं होते हैं।
एक्सोन्यूक्लिएज वे एंजाइम हैं जो $DNA$ अणुओं के मुक्त सिरों से न्यूक्लियोटाइड्स को हटाते हैं।
चूंकि रिकॉम्बिनेंट प्लाज्मिड $DNA$ में मुक्त $3'$ या $5'$ सिरे नहीं होते हैं,इसलिए यह एक्सोन्यूक्लिएज एंजाइम के लिए सब्सट्रेट के रूप में कार्य नहीं करेगा।
अतः,रिकॉम्बिनेंट $DNA$ की अखंडता बनी रहती है और बैक्टीरियल ट्रांसफॉर्मेशन की प्रक्रिया योजना के अनुसार आगे बढ़ सकती है।

(B) $DNA$ अणुओं को अभिरंजित करने के लिए इथिडियम ब्रोमाइड $(EtBr)$ नामक यौगिक का उपयोग किया जाता है।
जब एगारोज़ जेल को $EtBr$ के साथ उपचारित किया जाता है और बाद में पराबैंगनी $(UV)$ प्रकाश के संपर्क में लाया जाता है,तो $DNA$ के टुकड़े नारंगी प्रतिदीप्ति (fluorescence) उत्सर्जित करते हैं।
इससे जेल पर $DNA$ के बैंड को देखा जा सकता है।